信息来源：互联网   发布时间：2023-12-25

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引证本文：全敏,邢卉春.Beclin1介导NS5ATP9对饥饿诱导的HepG2细胞凋亡的作用 [J].肝脏,2022,27(07):782-784. 作者单位：100015 北京 首都医科

 

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引证本文：全敏,邢卉春.Beclin1介导NS5ATP9对饥饿诱导的HepG2细胞凋亡的作用 [J].肝脏,2022,27(07):782-784. 作者单位：100015 北京 首都医科大学附属北京地坛医院肝病中心肝病三科

通信作者：邢卉春，Email:huichunxing@126.com.

Beclin1介导NS5ATP9对饥饿诱导的HepG2细胞凋亡的作用

【摘要】 目的 探讨Beclin 1在NS5ATP9抑制饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡中的作用方法 将HepG2细胞用EBSS饥饿不同时间点，通过蛋白质印迹法检测NS5ATP9、Beclin1及bax蛋白的表达变化；将NS5ATP9的siRNA及过表达载体分别转染HepG2细胞48h后，用 EBSS饥饿细胞24h，通过蛋白质印迹检测bax的变化；应用Beclin 1siRNA抑制Beclin 1表达后，转染NS5ATP9过表达载体，EBSS饥饿细胞24h，利用化学发光法检测胱冬肽酶-3/7(caspase-3/7)的活性变化，同时用蛋白质印迹法检测NS5ATP9、Beclin1，bax蛋白的表达变化。

结果 饥饿HepG2细胞0、6、12、18、24h后，NS5ATP9及bax的蛋白表达量相应升高NS5ATP9表达被抑制后，bax蛋白表达量增加饥饿HepG2细胞24h后，Beclin 1表达被抑制，caspase-3/7的活性增加(。

P=0.001)，NS5ATP9抑制caspase-3/7活性的作用减弱(P<0.01)NS5ATP9对bax的负性调控作用减弱结论 Beclin 1通过下调bax的表达部分参与了NS5ATP9抑制饥饿诱导HepG2细胞凋亡的作用。

【关键词】NS5ATP9；饥饿；细胞凋亡，Beclin 1，bax

NS5ATP9是丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因，在多种恶性肿瘤细胞及癌组织中高表达，参与肿瘤细胞增殖和凋亡，DNA损伤后修复等[1-4]研究发现，NS5ATP9在细胞饥饿时表达增加，有抑制肝母细胞瘤细胞凋亡的作用，此外其可以上调Beclin 1的表达，促进肝母细胞瘤细胞增殖，而Beclin 1与多种肿瘤发展关系密切，抑制Beclin 1表达能增强肝癌对抗肿瘤药物的敏感性。

[5-8]。本实验探讨Beclin 1是否参与了NS5ATP9抑制饥饿诱导的肝母细胞瘤细胞凋亡的作用。

资料与方法一、实验材料肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞[9]及pcDNA3.1/myc-His(-)-NS5ATP9(pNS5ATP9)表达载体及对照空载体pcDNA3.1/myc-His(-)(pNC)均为本实验室保存。

NS5ATP9 siRNA(si-NS5ATP9)和Beclin 1 siRNA(si-Beclin 1，sc-29797) 和各自的对照载体(二)si-NC由santa Cruz公司合成[10]细胞培养基(DMEM)、平衡盐溶液EBSS及胎牛血清购自美国Gibco公司；转染试剂盒jetPRIMETM购自美国Polyplus Transfection公司；caspase-Gl。

oⓇ3/7试剂盒购自美国Promega公司二、实验方法(一)细胞培养及重组质粒转染 HepG2细胞用DMEM(含10%胎牛血清)于体积分数为0.05的CO2孵箱中培养，根据说明书转染重组质粒或siRNA及相应对照。

(二)细胞总蛋白抽提 细胞裂解液(5872s, CST,美国)裂解细胞，提取总蛋白，完成蛋白定量用12% NUPAGE Bis-Tris凝胶电泳(NP0034，Invitrogen，Grand Island，美国)。

然后转移至PVDF膜(ISEQ00010，Milipore，Billerica，美国) ；用5%脱脂奶粉配置1×TBST封闭液，依次与一抗Beclin 1抗体 (3495，CST，美国)、NS5ATP9抗体 (ab56773，Abcam,香港)、GAPDH抗体(5174，CST)、bax抗体(2772，CST，美国)、β-Actin抗体(4967，CST，美国)及二抗反应。

最后显色，置于成像仪下曝光显影，保存图像(三)胱冬肽酶-3/7酶活性检测 caspase-3作为凋亡过程中的关键执行分子，通过caspase-3/7活性检测可反映细胞凋亡的程度按照试剂盒操作检测caspase-3/7活性。

三、统计学方法应用SPSS 26.0软件统计分析。组间两两比较采用单因素方差分析，以P<0.05代表差异有统计学意义。每个实验至少重复3次，数据以均数±标准差表示。

结  果一、NS5ATP9与bax蛋白表达EBSS培养细胞0、6、12、18、24h后，提取细胞总蛋白，蛋白质印迹检测NS5ATP9、Beclin1、bax蛋白表达量的变化随着饥饿时间的延长，NS5ATP9蛋白表达量逐渐升高，bax的表达呈升高趋势(图1)。

图1 饥饿HepG2细胞6、12、18、24h后，NS5ATP9蛋白表达升高，bax蛋白表达升高二、NS5ATP9表达增加或抑制后，bax表达量呈相反变化将si-NS5ATP9或pNS5ATP9转染HepG2细胞48h，EBSS饥饿细胞24h，提取总蛋白检测NS5ATP9、bax蛋白表达量的变化。

NS5ATP9表达增加组bax的表达量有下调趋势，NS5ATP9表达抑制组bax蛋白表达量有上调趋势(图2)

注：pNS5ATP9(+表示pNS5ATP9转染组，-表示对照载体转染组)；si-NS5ATP9(+表示si-NS5ATP9转染组，-表示对照si-NC转染组)图2 转染pNS5ATP9或si-NS5ATP9及其各自对照48h后，饥饿HepG2细胞24h，bax蛋白表达变化

三、Beclin 1表达被抑制后，NS5ATP9对凋亡的抑制作用减弱在转染si-Beclin 1 24h后再转染NS5ATP9过表达载体(pNS5ATP9)24h，EBSS培养细胞24h与对照组相比，si-Beclin 1转染组，caspase-3/7活性显著增加；与对照组相比，pNS5ATP9转染组，caspase-3/7活性显著降低；在pNS5ATP9转染的两组组内比较，si-Beclin 1转染组caspase-3/7活性显著增加，差异均有统计学意义(。

P<0.05)。见表1。

四、Beclin 1表达被抑制后，NS5ATP9对bax下调作用减弱在HepG2 细胞内转染si-Beclin 1 24h后转染NS5ATP9过表达载体(pNS5ATP9)24h，EBSS培养细胞24h。

与对照组相比，NS5ATP9过表达组bax的表达量减少在si-Beclin 1转染的两组组内比较，NS5ATP9过表达组bax表达量减低，在NS5ATP9过表达的的两组组内比较，si-Beclin 1转染组，bax表达量增加。

说明Beclin 1被抑制后，削弱了NS5ATP9对HepG2细胞凋亡的抑制作用(图3)

图3 先后转染si-Beclin 1及pNS5ATP9 24h后，饥饿HepG2细胞24h bax蛋白表达量

讨  论NS5ATP9在肝癌组织较癌旁组织及正常肝组织中表达明显升高，与肝癌的分期、恶性程度、不良预后相关，寻找NS5ATP9在肝癌细胞凋亡中的作用及机制对防治肝癌有重要价值[11-13]NS5ATP9可以上调Beclin 1介导饥饿诱导的细胞自噬。

[6, 10]，并有抑制饥饿诱导的HepG2细胞凋亡的作用[5]肿瘤生长过快会出现营养缺乏的状态，探索饥饿状态下肝癌细胞抗凋亡的机制对抗肿瘤有帮助bax基因是一种促凋亡基因，bax变化与凋亡水平相一致本研究发现，随着HepG2细胞饥饿时间延长，bax蛋白表达量与NS5ATP9均有升高趋势。

前期研究结果已明确NS5ATP9在饥饿时的表达增加对HepG2细胞凋亡有抑制作用[5]本研究结果显示在饥饿HepG2细胞的同时抑制NS5ATP9的表达，再次检测bax的蛋白表达升高，caspas3/7活性也相应增强，证实在饥饿状态下NS5ATP9的高表达会下调bax的表达。

Beclin 1 在不同肿瘤中的作用并不一致，有研究应用肝癌组织基因芯片，发现Beclin 1 mRNA在肝肿瘤组织和肝癌细胞中表达明显高于正常肝组织及肝细胞[14]本研究在抑制Beclin 1表达后再次检测NS5ATP9对HepG2细胞caspas3/7活性和bax表达的影响，结果显示caspas3/7活性增强，并且bax表达增加。

然而抑制Beclin 1并没有完全阻抑NS5ATP9对HepG2细胞凋亡的抑制作用，推测Beclin 1部分参与了NS5ATP9对HepG2细胞凋亡的抑制作用Beclin 1在抗肝癌的研究中也是热点基因。

[15]，褪黑素可通过抑制PERK-ATF4-Beclin 1抑制自噬，增强肝癌对索拉非尼的敏感性[7]另有研究显示，FTY720(抗肿瘤药物)与si-Beclin 1共转染肝癌细胞后，肝癌细胞对FTY720的敏感性增加。

[8]。本研究发现Beclin 1在NS5ATP9抑制饥饿诱导HepG2细胞凋亡中所起的作用，为未来Beclin 1作为靶点基因在抗肝癌药物中的应用提供参考价值。

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